在培養箱內通過時間序列熒光顯微觀察活細胞增殖過程，核心是在維持細胞生理活性的前提下，通過 “特異性熒光標記 + 自動化長時程成像 + 定量分析"，動態捕捉細胞從 G1 期到分裂為兩個子細胞的完整周期，同時避免環境波動（溫度、CO?）和光毒性對增殖的干擾。以下從技術體系構建、實驗操作流程、數據定量方法及關鍵注意事項展開，提供可落地的研究方案：

一、核心技術體系：適配 “培養箱內" 與 “活細胞增殖" 的特殊需求

細胞增殖是連續的動態過程（如 HeLa 細胞周期約 24 小時），且對環境敏感（溫度波動 ±1℃即可影響周期進程），需針對性解決 “環境穩定性"“標記特異性"“成像低損傷" 三大核心問題，技術選型如下：

技術模塊核心需求推薦方案關鍵優勢

培養箱內成像系統1. 嵌入培養箱，維持 37℃、5% CO?、高濕度；

2. 自動化定時成像，減少人為干擾；

3. 兼容熒光與明場，滿足增殖觀察1. 專用培養箱內成像儀：如 Incucyte SX5、JuLI Br；

2. 定制化顯微鏡 + 培養艙：普通倒置熒光顯微鏡搭配恒溫 / 恒 CO?密閉艙（如 Tokai Hit 培養艙）1. 無環境波動，細胞增殖狀態更接近生理水平；

2. 支持 72-120 小時連續成像，覆蓋多代細胞增殖；

3. 低振動設計，避免成像漂移

細胞增殖熒光標記1. 標記細胞核（區分單個細胞，計數增殖數量）；

2. 無毒性 / 低毒性，不影響細胞周期；

3. 熒光穩定，適配長時程觀察1. 活細胞細胞核探針：Hoechst 33342（激發 350nm，發射 461nm，低毒性，2-5μg/mL 濃度可維持 48 小時）、SiR-DNA（遠紅外熒光，激發 652nm，發射 674nm，光毒性極低，適合 72 小時以上觀察）；

2. 增殖特異性熒光蛋白：基因編輯細胞（如 Ki67-GFP，Ki67 僅在增殖細胞中表達，可區分增殖 / 靜息細胞）1. 細胞核標記清晰，便于計數分裂細胞；

2. 遠紅外熒光（如 SiR-DNA）可減少光毒性，適合長期追蹤；

3. 增殖特異性標記（Ki67-GFP）可直接篩選增殖細胞群體

長時程成像參數1. 低光劑量，避免光毒性導致增殖停滯；

2. 合適時間間隔，完整捕捉分裂過程；

3. 足夠視野數量，保證統計可靠性1. 激發光強度：熒光通道≤20%（如 Hoechst 通道激發光強度 10%-15%）；

2. 曝光時間：熒光通道 50-200ms，明場通道 10-50ms；

3. 時間間隔：15-30 分鐘 / 次（短于細胞分裂時長，避免漏拍分裂過程）；

4. 視野數量：96 孔板每孔拍 3-5 個視野，覆蓋不同細胞密度區域1. 光毒性降至低，細胞增殖率與常規培養無差異；

2. 每 24 小時可獲取 48-96 張圖像，完整記錄細胞從間期到分裂的動態；

3. 多視野數據減少抽樣誤差，統計結果更可靠

二、實驗操作流程：從細胞準備到成像啟動的完整步驟

以 “96 孔板培養 HeLa 細胞，用 Hoechst 33342 標記，培養箱內連續 72 小時觀察增殖" 為例，詳細流程如下：

1. 細胞準備：確保初始狀態一致，減少實驗問題

細胞接種：

選擇對數生長期的 HeLa 細胞（增殖活性穩定），用胰酶消化后制成單細胞懸液，計數調整濃度至5×103-1×10? cells / 孔（96 孔板，每孔加 100μL 培養基）；

接種后將 96 孔板放入 37℃、5% CO?培養箱，靜置 24 小時（讓細胞貼壁并恢復活性，避免初始狀態波動影響增殖）。

熒光標記：

配制2×Hoechst 33342 工作液（用培養基稀釋，終濃度 2μg/mL，避免濃度過高導致細胞毒性）；

每孔吸棄 50μL 舊培養基，加入 50μL 2× 工作液，輕輕吹打混勻，放回培養箱孵育 30 分鐘（確保細胞核充分染色）；

孵育后無需洗去多余探針（Hoechst 33342 可在細胞內維持 48-72 小時，且低濃度下無明顯毒性），直接轉移至培養箱內成像系統。

2. 成像系統設置：平衡成像質量與細胞保護

以 Incucyte SX5 為例，參數設置需圍繞 “低光損傷" 和 “動態捕捉" 優化：

通道選擇：同時開啟 “明場"（觀察細胞形態，輔助判斷細胞活性）和 “藍色熒光通道"（Hoechst 33342，標記細胞核）；

成像參數：

明場：曝光時間 15ms，增益 1.0（避免強光照射）；

藍色熒光：激發光強度 12%，曝光時間 100ms，增益 1.2（信號清晰且光劑量低）；

時間序列設置：

時間間隔：20 分鐘 / 次（HeLa 細胞分裂約 18-24 小時，20 分鐘間隔可完整記錄分裂的 “核膜消失→染色體分離→核膜重建" 過程）；

總時長：72 小時（覆蓋 3 代細胞增殖，觀察增殖速率變化）；

視野選擇：每孔選擇 4 個視野（孔的中心 + 四周各 1 個，避免邊緣效應導致的細胞密度不均），確保每個視野初始細胞數約 20-30 個（便于統計增殖倍數）。

3. 成像啟動與實時監控：及時排除異常

啟動成像后，前 3 個循環（1 小時內）需實時查看圖像：

明場圖像：細胞貼壁良好，無皺縮、漂浮（排除接種或標記導致的細胞損傷）；

熒光圖像：細胞核染色均勻，無明顯背景噪音（若背景高，可適當降低增益或更換新鮮培養基）；

若發現部分視野細胞密度過高（可能導致后期重疊，影響計數），可補充設置低細胞密度孔的成像（如初始接種 3×103 cells / 孔）；

成像過程中無需打開培養箱（系統自動完成），避免環境波動影響增殖。

三、數據定量分析：從圖像到增殖指標的轉化

72 小時成像會生成大量時間序列圖像（如 96 孔板 ×4 視野 ×216 次循環 = 82944 張圖像），需通過 “圖像預處理→細胞計數→增殖參數計算" 三步解析，常用工具包括Incucyte Analysis Software（自帶）、ImageJ（Fiji）（開源，需安裝 “Cell Counter" 插件）。

1. 圖像預處理：消除干擾，統一數據標準

背景扣除：針對熒光通道，用 “滾動球背景扣除"（Fiji：Process→Subtract Background，滾動球半徑 50 像素）去除培養皿背景熒光，確保僅細胞核信號被計數；

去噪：用 “高斯濾波"（Fiji：Process→Filters→Gaussian Blur，sigma=1.0 像素）消除隨機噪音，避免誤判為細胞；

閾值分割：熒光通道設置固定閾值（如基于初始時間點的陰性對照孔，確定 “細胞核信號 - 背景" 的分界值），將細胞核轉化為黑白二值圖像（便于自動計數）。

2. 核心增殖指標計算：量化增殖效率與動態

通過計數不同時間點的細胞核數量，結合時間維度，提取關鍵增殖指標，反映細胞增殖的動態規律：

增殖指標定義計算方法生物學意義

細胞總數增長曲線不同時間點的總細胞數隨時間變化每個時間點（如 0h、24h、48h、72h）統計所有視野的細胞核總數，繪制 “細胞數 - 時間" 曲線直觀反映增殖趨勢（如對數期、平臺期的出現時間）

增殖倍數某時間點細胞數與初始時間點的比值增殖倍數 =（t 時刻細胞數）/（0h 時刻細胞數）量化整體增殖效率（如 72h 增殖倍數 = 5.0，代表 5 倍增長）

群體倍增時間（PDT）細胞總數翻倍所需的時間基于對數期數據（如 24h-48h），用公式：PDT = (t2 - t1) × log2 / (logN2 - logN1)（N1=t1 時刻細胞數，N2=t2 時刻細胞數）比較不同組（如對照組 vs 藥物處理組）的增殖速率（PDT 越短，增殖越快）

分裂率單位時間內發生分裂的細胞數占總細胞數的比例手動或自動追蹤細胞核分裂事件（如 1 個細胞核分裂為 2 個），分裂率 =（分裂細胞數）/（總細胞數）×100%反映細胞進入分裂期的比例（如分裂率下降，提示增殖受抑制）

細胞周期時長單個細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束的時間用 “細胞追蹤" 功能（如 Incucyte 的 “Cell Tracking" 模塊）標記單個細胞，記錄其兩次分裂的時間差，統計多個細胞的平均值分析單個細胞層面的周期異質性（如部分細胞周期延長，可能提示應激）

3. 結果可視化：清晰呈現增殖動態

增長曲線：用 GraphPad Prism 繪制 “細胞總數 - 時間" 折線圖（帶誤差線，每組 3 個復孔），標注對數期、平臺期的區間；

分裂動態視頻：將單個視野的時間序列圖像合成為視頻（Fiji：Image→Stacks→Make Movie），直觀展示細胞從單個分裂為多個的過程（如細胞核先變大、再分裂為兩個）；

熱圖：用 Excel 或 Origin 繪制 “不同時間點 - 不同孔的增殖倍數熱圖"，快速對比多組（如不同藥物濃度）的增殖差異。

四、關鍵注意事項：避免實驗誤差與細胞損傷

熒光標記的毒性控制：

Hoechst 33342 終濃度需≤5μg/mL（濃度過高會抑制 DNA 復制，導致增殖停滯），且成像時藍色激發光強度≤15%（避免光毒性疊加）；

若需觀察超過 72 小時，優先選擇 SiR-DNA（遠紅外熒光，光毒性遠低于 Hoechst），或采用 “脈沖標記"（如每天孵育 30 分鐘后洗去，減少探針積累）。

環境穩定性維護：

培養箱內成像系統需定期校準溫度和 CO?濃度，避免因環境波動導致增殖速率異常；

96 孔板需用封口膜密封（僅留透氣孔），防止培養基蒸發導致滲透壓升高（尤其 72 小時以上成像）。

數據可靠性驗證：

每組實驗至少 3 個生物學重復（不同批次細胞），每個重復 3 個技術重復（同批次不同孔），避免單次實驗誤差；

計數時需排除 “細胞重疊" 干擾（如用 ImageJ 的 “Watershed" 功能分割重疊細胞核），或選擇初始細胞密度較低的視野（避免后期重疊）。

細胞活性監控：

結合明場圖像判斷細胞活性（若細胞皺縮、變圓，即使細胞核存在，也需排除在增殖計數外）；

可額外添加 “活細胞熒光探針"（如 Calcein-AM，綠色熒光標記活細胞），同時監控活性與增殖，確保計數的是活細胞。

五、典型應用場景

藥物增殖抑制篩選：觀察不同濃度化療藥物（如順鉑）對腫瘤細胞（如 A549）增殖的影響，計算 PDT 和分裂率，篩選最佳抑制濃度；

干細胞增殖分化研究：觀察間充質干細胞（MSC）在不同誘導條件下的增殖速率變化（如成骨誘導時增殖是否減慢），結合分化標志物熒光標記，關聯增殖與分化；

病毒感染對增殖的影響：觀察新冠病毒感染 Vero 細胞后，細胞增殖是否停滯（如計算感染后 24h、48h 的增殖倍數，與未感染組對比）。

綜上，培養箱內時間序列熒光顯微觀察活細胞增殖，核心是 “穩定環境 + 低毒標記 + 定量分析" 的結合。通過精準控制實驗條件和優化數據分析，可客觀反映細胞增殖的動態規律，為細胞生物學研究、藥物篩選等提供可靠的動態觀測證據。