相差 - 熒光活細胞顯微時間序列動態(tài)觀察，是將相差顯微鏡技術(shù)與熒光顯微鏡技術(shù)結(jié)合，對活細胞進行長時間、周期性的動態(tài)成像記錄，從而實時追蹤細胞形態(tài)變化、亞細胞結(jié)構(gòu)動態(tài)及分子表達 / 定位等過程的前沿顯微成像方法。該技術(shù)既解決了活細胞無標記觀察的需求，又實現(xiàn)了特異性分子靶向追蹤，是細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域研究活細胞動態(tài)行為的核心手段。

一、核心技術(shù)原理：相差與熒光的 “互補協(xié)作"

該技術(shù)的核心是兩種顯微技術(shù)的協(xié)同 —— 相差技術(shù)負責(zé) “無標記看形態(tài)"，熒光技術(shù)負責(zé) “特異性看分子"，二者結(jié)合實現(xiàn)活細胞動態(tài)的 “全景 + 精準" 觀察。

1. 相差顯微鏡技術(shù)：無標記觀察活細胞形態(tài)

活細胞通常透明（折射率與周圍培養(yǎng)基差異小），普通明場顯微鏡難以分辨細節(jié)。相差技術(shù)通過將細胞內(nèi)部折射率差異轉(zhuǎn)化為明暗對比，無需染色即可觀察活細胞的形態(tài)、運動及內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如細胞核、線粒體、細胞膜邊緣），避免了染色對細胞活性的破壞。

關(guān)鍵原理：利用光的 “相位差"（光穿過細胞不同結(jié)構(gòu)時，因折射率不同導(dǎo)致傳播速度差異，產(chǎn)生相位差），通過顯微鏡內(nèi)的 “相差板" 將不可見的相位差轉(zhuǎn)化為可見的 “振幅差"（明暗差異），使透明細胞呈現(xiàn)清晰的明暗對比圖像。

優(yōu)勢：無標記、不損傷細胞，可長期觀察細胞存活狀態(tài)；適合觀察細胞貼壁、遷移、分裂等宏觀動態(tài)行為。

2. 熒光顯微鏡技術(shù)：特異性追蹤分子 / 亞細胞結(jié)構(gòu)

熒光技術(shù)通過 “熒光探針"（如熒光染料、熒光蛋白）與細胞內(nèi)特定靶點（如 DNA、蛋白質(zhì)、細胞器膜）特異性結(jié)合，在激發(fā)光照射下探針發(fā)出熒光，從而實現(xiàn)對目標結(jié)構(gòu)的精準定位和動態(tài)追蹤。

關(guān)鍵原理：基于 “熒光現(xiàn)象"—— 熒光探針吸收特定波長的激發(fā)光后，電子躍遷到高能級，再回到基態(tài)時釋放出波長更長的熒光；顯微鏡通過 “激發(fā)濾光片"（篩選激發(fā)光）、“ dichroic 鏡"（反射激發(fā)光、透過熒光）和 “發(fā)射濾光片"（篩選熒光），僅采集目標熒光信號，排除背景干擾。

常用探針舉例：

細胞核標記：DAPI（結(jié)合 DNA，發(fā)藍色熒光）；

細胞骨架標記：Alexa Fluor 488 - 鬼筆環(huán)肽（結(jié)合肌動蛋白，發(fā)綠色熒光）；

分子表達追蹤：GFP（綠色熒光蛋白，融合到目標蛋白上，實現(xiàn)動態(tài)定位）。

3. 時間序列成像：動態(tài)記錄細胞行為

通過顯微鏡的自動控制模塊（如電動載物臺、自動聚焦、快門控制），按設(shè)定的時間間隔（如每 5 分鐘、每 1 小時）對同一視野的細胞進行連續(xù)成像，生成 “時間序列圖像棧" 或動態(tài)視頻。結(jié)合圖像分析軟件（如 ImageJ、MetaMorph），可量化分析細胞遷移速度、分裂周期、熒光信號強度變化等參數(shù)。

二、核心應(yīng)用場景：聚焦 “活細胞動態(tài)過程"

該技術(shù)因能兼顧 “無損傷" 與 “特異性"，廣泛應(yīng)用于需實時追蹤細胞動態(tài)的研究領(lǐng)域：

應(yīng)用領(lǐng)域具體研究方向技術(shù)價值

細胞生物學(xué)細胞分裂周期追蹤、細胞遷移 / 侵襲、細胞凋亡動態(tài)無標記觀察分裂形態(tài)，同時用熒光標記染色體（如 H2B-GFP），精準定位分裂階段

發(fā)育生物學(xué)早期胚胎發(fā)育（如斑馬魚 / 線蟲胚胎細胞分化）、干細胞分化動態(tài)長期記錄胚胎細胞增殖分化過程，熒光標記分化標志物（如 Oct4、Sox2）

藥理學(xué)藥物對細胞的動態(tài)影響（如藥物誘導(dǎo)的細胞骨架重組、凋亡過程）實時觀察藥物作用下細胞形態(tài)變化，同時用熒光探針檢測凋亡信號（如 Annexin V）

分子生物學(xué)蛋白質(zhì)定位與轉(zhuǎn)運（如膜蛋白內(nèi)吞、細胞器間物質(zhì)交換）熒光標記目標蛋白，追蹤其在細胞內(nèi)的動態(tài)移動路徑

病毒學(xué)病毒入侵宿主細胞的過程（如新冠病毒與細胞膜結(jié)合、病毒顆粒在細胞內(nèi)擴散）熒光標記病毒顆粒（如 GFP 標記病毒衣殼蛋白），實時記錄入侵步驟

三、關(guān)鍵技術(shù)挑戰(zhàn)與解決方案

活細胞長時間成像需克服 “細胞存活" 與 “成像質(zhì)量" 的矛盾，核心挑戰(zhàn)及應(yīng)對策略如下：

1. 細胞活性維持：避免成像過程損傷細胞

長時間成像（數(shù)小時至數(shù)天）中，光照、溫度、CO?濃度等均可能影響細胞存活，需通過 “環(huán)境控制模塊" 解決：

溫度控制：顯微鏡載物臺配備加熱板 / 加熱套，維持 37℃（哺乳動物細胞）恒溫，避免溫度波動導(dǎo)致細胞代謝紊亂；

氣體控制：內(nèi)置 CO?培養(yǎng)小室（通入 5% CO?），維持培養(yǎng)基 pH 穩(wěn)定（避免 pH 變化導(dǎo)致細胞凋亡）；

濕度控制：小室加裝濕度模塊，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致滲透壓升高；

光毒性抑制：

選擇 “低光毒性熒光探針"（如 GFP 變體 mNeonGreen，比傳統(tǒng) GFP 更亮，可降低激發(fā)光強度）；

采用 “脈沖式激發(fā)"（縮短激發(fā)光照射時間，如每次照射 10-50ms），減少光對細胞的氧化損傷；

優(yōu)先用相差成像記錄形態(tài)，僅在關(guān)鍵時間點啟動熒光成像。

2. 成像穩(wěn)定性：避免長時間成像的 “漂移"

長時間成像中，載物臺位移、焦距偏移（如培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致液面下降）會導(dǎo)致圖像模糊，需通過 “自動校正模塊" 解決：

自動聚焦（Auto-focus）：基于 “對比度檢測" 或 “激光反射聚焦"，每次成像前自動調(diào)整物鏡焦距，確保細胞始終處于焦平面；

自動載物臺校正（Auto-stage correction）：通過圖像中 “參考標記"（如培養(yǎng)皿邊緣、固定的細胞結(jié)構(gòu)），實時校正載物臺的 X/Y 軸位移；

使用高穩(wěn)定性載物臺：采用無振動的電動載物臺，避免環(huán)境振動（如實驗室人員走動）對成像的影響。

3. 圖像信噪比：排除背景干擾，清晰捕捉信號

活細胞成像中，背景熒光（如培養(yǎng)基自發(fā)熒光、細胞 autofluorescence）會影響信號質(zhì)量，需通過 “光學(xué)優(yōu)化 + 軟件處理" 解決：

光學(xué)層面：

使用 “高數(shù)值孔徑（NA）物鏡"（如 NA 1.4 的油鏡），提高熒光信號采集效率；

搭配 “共聚焦掃描模塊"（可選升級），通過針孔排除焦外熒光，顯著提升信噪比（適合厚樣本或高背景場景）；

軟件層面：

成像后用軟件（如 ImageJ）進行 “背景扣除"“平滑濾波"，減少噪聲干擾；

對時間序列圖像進行 “配準"，校正微小位移導(dǎo)致的信號偏移。

四、典型實驗流程示例（以 “細胞遷移追蹤" 為例）

樣本制備：將待觀察細胞（如 HeLa 細胞）接種到 “玻璃底培養(yǎng)皿"（適配顯微鏡載物臺，保證光學(xué)清晰度），加入含血清的培養(yǎng)基，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中貼壁生長至 50%-70% 融合度；

熒光標記（可選）：若需標記特定結(jié)構(gòu)（如細胞骨架），加入熒光探針（如 Alexa Fluor 488 - 鬼筆環(huán)肽），37℃孵育 20 分鐘，用 PBS 洗去未結(jié)合探針，加入新鮮培養(yǎng)基；

顯微鏡 setup：將培養(yǎng)皿放入顯微鏡的 “環(huán)境控制小室"，設(shè)定溫度 37℃、CO?濃度 5%，等待 10 分鐘讓細胞適應(yīng)環(huán)境；

視野選擇與參數(shù)設(shè)定：

在明場 / 相差模式下找到目標視野（選擇細胞分布均勻、無明顯雜質(zhì)的區(qū)域）；

設(shè)定成像模式：同時采集 “相差圖像"（記錄細胞形態(tài)）和 “熒光圖像"（記錄細胞骨架）；

設(shè)定時間序列參數(shù)：成像間隔 10 分鐘，總成像時間 12 小時（共 72 個時間點），每個視野拍攝 3 個 Z 軸層面（避免焦距漂移）；

啟動成像：開啟自動成像程序，期間避免觸碰顯微鏡或?qū)嶒炁_，防止振動；

數(shù)據(jù)分析：

用 ImageJ 導(dǎo)入時間序列圖像棧，進行背景扣除、Z 軸投影（取最清晰層面）；

使用 “細胞追蹤插件"（如 TrackMate）標記單個細胞，計算細胞遷移軌跡、遷移速度、方向角等參數(shù)；

結(jié)合熒光信號強度分析，觀察細胞遷移過程中細胞骨架的動態(tài)變化（如絲狀偽足的伸出與收縮）。

綜上，相差 - 熒光活細胞顯微時間序列動態(tài)觀察技術(shù)，通過 “無標記 + 特異性標記" 的協(xié)同優(yōu)勢，為活細胞動態(tài)行為研究提供了高時空分辨率的可視化工具，其核心是在 “細胞存活" 與 “成像質(zhì)量" 之間找到平衡，同時依賴精準的環(huán)境控制和后期數(shù)據(jù)分析，才能充分發(fā)揮其在生命科學(xué)研究中的價值。