奧林巴斯倒置CKX53顯微鏡結合網格計數板是觀察和計數細菌的常用組合，其操作簡便、成像清晰，適用于微生物學、環境科學及工業發酵等領域的細菌定量分析。以下從設備準備、樣本處理、觀察計數及注意事項四個方面進行系統性說明：

一、設備與材料準備

顯微鏡配置

奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡：

光源：優先選用LED光源（如CKX-LED），提供穩定均勻的照明，減少熱量對細菌活性的影響。

物鏡：根據細菌大小選擇10×、20×或40×物鏡（NA≥0.25），確保視野清晰且覆蓋網格區域。

目鏡：10×目鏡（視野直徑約1.8-2.0mm）適合常規計數，若需更高精度可換用15×或20×目鏡。

網格計數板：

類型：常用血細胞計數板（如Neubauer改進型）或專用細菌計數板（如Petroff-Hausser計數室）。

規格：

Neubauer計數板：中央區域分為25個中方格，每個中方格含16個小方格（邊長0.2mm，面積0.04mm2），深度0.1mm（體積0.004mm3=0.000004mL）。

細菌專用計數板：網格更細（如0.02mm2/小方格），適合高密度樣本。

輔助工具

蓋玻片（厚度0.17mm）、載玻片（可選）、移液器（10μL量程）、無菌吸頭、酒精棉球、記號筆。

二、樣本處理與制片

樣本稀釋

目的：將細菌濃度調整至20-200個/中方格（Neubauer計數板）或50-150個/小方格（細菌專用板），避免過度密集或稀疏。

方法：

初步估算濃度：取10μL樣本與990μL無菌水混合（1:100稀釋），重復稀釋至合適范圍。

制片步驟

清潔計數板：用酒精棉球擦拭計數板和蓋玻片，晾干后避免指紋污染。

蓋玻片放置：將蓋玻片輕壓在計數室上，確保無氣泡且邊緣密封（防止樣本溢出）。

加樣：用移液器吸取10μL稀釋后的樣本，從計數室邊緣緩慢注入，利用毛細作用使樣本均勻填充計數室。

靜置：等待2-3分鐘使細菌沉降，避免移動計數板導致分布不均。

三、顯微鏡觀察與計數

顯微鏡設置

對焦：切換至相差模式（若CKX53配備相差附件）或明場模式，調節粗/細準焦螺旋使網格線清晰可見。

光源調整：降低光源強度至適中（避免熒光干擾或細菌光損傷），關閉聚光鏡虹彩光圈以減少眩光。

視野選擇：優先計數中央區域（如Neubauer計數板的4個角及中央共5個中方格），減少邊緣效應。

計數規則

邊界處理：對壓線細菌采用“數上不數下、數左不數右"原則（或統一計數上邊和左邊的細菌）。

死菌區分：若需區分活菌與死菌，可提前用臺盼藍染色（活菌拒染，死菌染藍），或通過形態差異（如破碎細胞）判斷。

重復計數：對同一樣本重復計數2-3次，取平均值以提高準確性。

四、注意事項與優化技巧

避免誤差來源

樣本均勻性：稀釋后充分混勻，避免細菌沉降導致濃度不均。

網格對齊：確保計數板網格與顯微鏡視野十字線平行，減少計數偏差。

時間控制：計數應在樣本制備后30分鐘內完成，防止細菌繁殖或死亡影響結果。

特殊場景處理

高密度樣本：進一步稀釋至可計數范圍，或改用熒光染色結合自動計數軟件（如ImageJ的Cell Counter插件）。

運動性細菌：在樣本中加入少量甲醛（終濃度0.5%）固定細菌，或使用瓊脂覆蓋法限制運動。

鏈狀/簇狀細菌：記錄鏈或簇的數量，按單個細菌計算（或根據研究需求調整規則）。

設備維護

清潔：使用后用壓縮空氣吹除計數板殘留樣本，避免腐蝕金屬部件。

校準：定期檢查顯微鏡光源強度、物鏡分辨率及網格計數板精度（如通過標準微球驗證）。

五、應用案例

發酵工業：監測乳酸菌發酵過程中的活菌數變化，優化發酵條件（如pH、溫度）。

環境監測：計數水體中的大腸桿菌群落，評估水質污染程度。

臨床診斷：快速檢測尿液或血液中的病原菌濃度，指導抗生素用藥劑量。

通過規范操作和細節優化，奧林巴斯CKX53顯微鏡結合網格計數板可實現細菌濃度的快速、準確測定，為微生物研究提供可靠數據支持。