小鼠樹突狀細胞（Dendritic Cells, DCs）的熒光觀察是研究其成熟、抗原攝取與呈遞、遷移及免疫激活功能的重要手段。以下從樣本制備、熒光標記策略、成像技術選擇、實驗優化要點及典型應用場景五個方面，系統闡述小鼠DC細胞熒光觀察的關鍵步驟與注意事項：

一、樣本制備：高活性DC細胞的獲取

小鼠DC細胞來源

骨髓來源DC（BMDC）：

步驟：取6-8周齡C57BL/6小鼠股骨/脛骨，用RPMI-1640培養基沖洗骨髓腔，離心后重懸于含GM-CSF（20 ng/mL）和IL-4（10 ng/mL）的培養基中，第3天半量換液，第6天收集非貼壁細胞（純度>80%）。

優勢：易獲取、分化狀態可控，適合研究DC成熟與功能調控。

脾臟來源DC：

步驟：機械研磨脾臟，通過密度梯度離心（如Percoll）分離低密度細胞，再用CD11c?磁珠分選（純度>90%）。

優勢：更接近體內成熟狀態，適合研究天然免疫應答。

細胞活性保障

低溫操作：所有步驟在冰上或4℃進行，避免酶活性喪失。

無血清培養基：使用X-VIVO 15或AIM V等無血清培養基，減少血清成分對熒光標記的干擾。

密度控制：接種密度為1×10? cells/mL，避免過度擁擠導致細胞自分泌因子抑制活性。

二、熒光標記策略：靶向DC功能關鍵分子

根據觀察目標選擇特異性標記物，需兼顧信號強度與功能影響：

觀察目標熒光標記物標記方法應用場景

成熟狀態CD80-FITC、CD86-PE、MHC II-APC抗體直接標記（流式/成像）評估TLR配體（如LPS）誘導的DC成熟

抗原攝取Dextran-Alexa Fluor 48837℃孵育30分鐘（內吞途徑標記）追蹤DC吞噬凋亡細胞或顆粒抗原

遷移能力CellTracker Green CMFDA終濃度5 μM，37℃孵育15分鐘活細胞遷移軌跡追蹤（Transwell）

細胞骨架Phalloidin-iFluor 555固定后標記（4% PFA，15分鐘）分析DC偽足形成與形態變化

細胞器動態MitoTracker Red CMXRos活細胞標記（終濃度200 nM，30分鐘）監測線粒體膜電位與能量代謝

信號通路激活NF-κB-GFP轉染慢病毒轉染（MOI=10）實時觀察TLR信號轉導動態

三、成像技術選擇：平衡分辨率與細胞活性

寬場熒光顯微鏡

適用場景：快速篩查大量細胞（如96孔板中DC成熟狀態）。

參數設置：

曝光時間：100-500 ms（根據熒光強度調整）。

濾光片：選擇與熒光標記物匹配的激發/發射波長（如FITC：Ex 488 nm, Em 525 nm）。

圖像拼接：使用20×物鏡掃描整個培養皿，拼接高分辨率全景圖。

共聚焦顯微鏡

適用場景：三維結構分析（如DC與T細胞共培養中的突觸形成）。

參數設置：

激光功率：<5%（避免光毒性）。

針孔大小：1 Airy單位（平衡分辨率與信噪比）。

Z軸步進：0.5 μm（覆蓋DC偽足高度）。

活細胞工作站

適用場景：長時間動態追蹤（如DC遷移軌跡或抗原處理過程）。

關鍵配置：

環境控制：37℃、5% CO?、飽和濕度。

成像頻率：每5-30分鐘一次（根據動態過程快慢調整）。

防漂移設計：使用硬件自動聚焦（如Perfect Focus System）。

四、實驗優化要點：減少干擾與提高可重復性

降低自發熒光

培養基選擇：避免使用酚紅（含苯酚紅培養基在488 nm激發下產生強熒光），改用無酚紅RPMI-1640。

耗材處理：使用低自發熒光玻璃底培養皿（如Corning 35 mm #1.5 coverglass），避免塑料底干擾。

標記條件優化

抗體濃度：通過滴定實驗確定最佳濃度（如CD80-FITC：1 μg/10? cells）。

標記時間：抗體標記需在冰上進行（減少內吞導致的非特異性結合），細胞器探針需在37℃標記（確保探針進入活細胞）。

數據質量控制

陰性對照：設置未標記組（背景熒光）和同型抗體對照組（非特異性結合）。

陽性對照：使用已知陽性細胞（如LPS刺激后的DC）驗證標記有效性。

重復驗證：至少3次獨立實驗，每次3個技術重復。

五、典型應用場景與案例

DC成熟與抗原呈遞研究

實驗設計：

分組：未處理組、LPS（100 ng/mL）刺激組、CpG ODN（1 μM）刺激組。

標記：CD80-FITC（成熟標志）、MHC II-APC（抗原呈遞能力）、Dextran-Alexa Fluor 488（抗原攝取）。

成像：共聚焦顯微鏡觀察DC表面標志物表達與抗原內吞共定位。

結果分析：LPS組CD80?MHC II?細胞比例顯著升高，Dextran熒光強度增加，表明DC成熟增強且抗原攝取能力提升。

DC-T細胞免疫突觸形成

實驗設計：

共培養：OT-II T細胞（CD4-CFSE標記）與OVA???????肽負載的DC（MHC II-PE標記）。

標記：Phalloidin-iFluor 555（細胞骨架）、p-ZAP70-Alexa Fluor 647（T細胞活化信號）。

成像：活細胞工作站動態追蹤免疫突觸形成過程（時間間隔5分鐘，總時長2小時）。

結果分析：DC偽足與T細胞接觸后，p-ZAP70在接觸區聚集，表明免疫突觸成功形成。

DC遷移與腫瘤免疫逃逸

實驗設計：

模型：將GFP標記的B16F10黑色素瘤細胞接種于小鼠耳部，局部注射CFSE標記的BMDC。

標記：CellTracker Red CMPTX（DC遷移追蹤）、Lyve-1-Alexa Fluor 647（淋巴管標記）。

成像：雙光子顯微鏡活體觀察DC向腫瘤引流淋巴結的遷移路徑。

結果分析：腫瘤微環境抑制DC遷移速度（遷移距離縮短30%），且部分DC滯留在腫瘤組織內，解釋腫瘤免疫逃逸機制。