在DC（樹突狀細(xì)胞）與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，免疫突觸的形成是觀察兩者相互作用的核心指標(biāo)，其觀察需結(jié)合熒光標(biāo)記、成像技術(shù)及功能驗證，以下從關(guān)鍵步驟、技術(shù)選擇及實驗優(yōu)化三方面展開說明：

一、關(guān)鍵步驟：共培養(yǎng)體系設(shè)計與熒光標(biāo)記

細(xì)胞來源與純化

DC：常用骨髓來源DC（BMDC）或單核細(xì)胞誘導(dǎo)的MoDC（如人外周血CD14?單核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF+IL-4誘導(dǎo)）。

T細(xì)胞：從同一供體分離CD4?或CD8? T細(xì)胞（如通過陰性選擇磁珠分選），純度需＞90%以減少非特異性干擾。

共培養(yǎng)條件：DC與T細(xì)胞比例通常為1:5至1:20，共培養(yǎng)時間6-24小時（突觸形成高峰期），可添加抗原肽（如OVA???????）或TLR配體（如LPS）誘導(dǎo)DC成熟。

熒光標(biāo)記策略

DC標(biāo)記：

膜標(biāo)記：CD11c-APC（DC特異性標(biāo)志）、MHC II-PE（抗原呈遞能力）。

功能標(biāo)記：CD80-FITC/CD86-FITC（共刺激分子，成熟標(biāo)志）。

T細(xì)胞標(biāo)記：

膜標(biāo)記：CD3-CFSE（追蹤增殖）、CD4-Pacific Blue/CD8-PerCP（亞群區(qū)分）。

功能標(biāo)記：p-ZAP70-Alexa Fluor 647（T細(xì)胞活化信號）、LFA-1-Alexa Fluor 555（黏附分子）。

細(xì)胞骨架標(biāo)記：Phalloidin-iFluor 555（標(biāo)記DC和T細(xì)胞的F-actin，觀察突觸處骨架重排）。

二、技術(shù)選擇：成像方法對比與推薦

共聚焦顯微鏡

優(yōu)勢：高分辨率（0.2 μm），可清晰顯示突觸處MHC-TCR、LFA-1-ICAM-1等分子對的聚集。

參數(shù)設(shè)置：

激光功率：＜5%（避免光毒性）。

針孔大小：1 Airy單位（平衡分辨率與信噪比）。

Z軸步進：0.5 μm（覆蓋DC偽足高度）。

案例：觀察DC與OT-II T細(xì)胞共培養(yǎng)時，MHC II與TCR在突觸處的共定位（Pearson相關(guān)系數(shù)＞0.7）。

成像流式細(xì)胞術(shù)（MIFC）

優(yōu)勢：高通量（每小時分析10?細(xì)胞），可量化突觸形成比例及信號強度。

設(shè)門策略：

聚焦細(xì)胞：根據(jù)“gradient RMS"特征選擇。

偶聯(lián)體識別：CFSE?（T細(xì)胞）與CD11c?（DC）雙陽性細(xì)胞。

Interface Mask：定義T-DC接觸界面，統(tǒng)計該區(qū)域phalloidin或LFA-1熒光強度。

案例：研究顯示，抗原呈遞后DC與T細(xì)胞突觸形成比例從15%升至45%（p＜0.01）。

活細(xì)胞工作站

優(yōu)勢：動態(tài)追蹤突觸形成過程（時間間隔5-30分鐘）。

關(guān)鍵配置：

環(huán)境控制：37℃、5% CO?、飽和濕度。

防漂移設(shè)計：硬件自動聚焦（如Perfect Focus System）。

案例：實時觀察DC偽足與T細(xì)胞接觸后，p-ZAP70在接觸區(qū)快速聚集（＜5分鐘）。

三、實驗優(yōu)化：減少干擾與提高可重復(fù)性

降低自發(fā)熒光

培養(yǎng)基：使用無酚紅RPMI-1640（避免488 nm激發(fā)下酚紅熒光干擾）。

耗材：采用低自發(fā)熒光玻璃底培養(yǎng)皿（如Corning 35 mm #1.5 coverglass）。

標(biāo)記條件優(yōu)化

抗體濃度：通過滴定實驗確定最佳濃度（如CD80-FITC：1 μg/10? cells）。

標(biāo)記時間：

膜抗體：冰上標(biāo)記30分鐘（減少內(nèi)吞導(dǎo)致的非特異性結(jié)合）。

細(xì)胞骨架探針：37℃標(biāo)記15分鐘（確保phalloidin進入活細(xì)胞）。

功能驗證

陰性對照：未標(biāo)記組（背景熒光）和同型抗體對照組。

陽性對照：使用已知陽性細(xì)胞（如LPS刺激后的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)）。

重復(fù)驗證：至少3次獨立實驗，每次3個技術(shù)重復(fù)。

四、典型結(jié)果與分析

突觸形成標(biāo)志

形態(tài)學(xué)：DC偽足與T細(xì)胞接觸，形成“牛眼樣"結(jié)構(gòu)（中心為MHC-TCR，外周為LFA-1-ICAM-1）。

量化數(shù)據(jù)：成像流式顯示，抗原呈遞組突觸界面phalloidin熒光強度較未處理組高3倍（p＜0.001）。

功能關(guān)聯(lián)

T細(xì)胞活化：突觸形成比例與T細(xì)胞IL-2分泌量呈正相關(guān)（r=0.85, p＜0.01）。

DC成熟：LPS刺激后DC與T細(xì)胞突觸形成效率提升50%，伴隨CD80/CD86表達(dá)上調(diào)。

五、技術(shù)局限性及解決方案

共聚焦顯微鏡：

問題：光毒性限制長時間觀察。

解決：使用低功率激光（＜5%）或光活化熒光蛋白（如PA-GFP）。

成像流式：

問題：偶聯(lián)體識別可能受細(xì)胞重疊干擾。

解決：結(jié)合“aspect ratio"和“area"參數(shù)排除非特異性雙陽性細(xì)胞。